對于同一個(gè)樣品,如果一步法恒溫試劑盒檢測結(jié)果為陽性,而PCR檢測為陰性,可能的原因包括:
1. 檢測的支原體種類不同:一步法恒溫試劑盒可能檢測的支原體種類更多,例如可以涵蓋27種支原體,而PCR檢測可能只針對常見的12種支原體進(jìn)行檢測。因此,如果樣品中污染的支原體種類不在PCR檢測的范圍內(nèi),就可能出現(xiàn)一步法檢測為陽性而PCR檢測為陰性的情況。
2. 靈敏度的差異:PCR方法的靈敏度可能高于一步法恒溫檢測法。PCR可以檢測到低至單個(gè)拷貝的支原體,而一步法恒溫檢測可能需要更高的支原體拷貝數(shù),例如10^3^個(gè)拷貝。如果樣品中支原體的數(shù)量低于一步法檢測的靈敏度閾值,PCR檢測可能無法檢測到,導(dǎo)致陰性結(jié)果。
3. 樣品中可能含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì):如果樣品中存在PCR反應(yīng)的抑制物,可能會影響PCR的擴(kuò)增效率,導(dǎo)致即使存在支原體,PCR檢測也可能呈現(xiàn)陰性結(jié)果。
4. 試劑盒的特異性和交叉反應(yīng):一步法恒溫試劑盒可能具有更高的特異性,減少了與其他微生物的交叉反應(yīng),從而在PCR檢測為陰性時(shí)仍能準(zhǔn)確檢測到支原體的存在。
細(xì)胞培養(yǎng)中支原體為什么難以徹底消滅?南京細(xì)胞培養(yǎng)支原體去除多少錢
支原體預(yù)防的策略主要包括以下幾個(gè)方面:
1. 控制污染源:通過定期檢測和去除細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染,確保細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)無支原體存在,從而獲得準(zhǔn)確有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
2. 改善無菌操作技術(shù):通過提高實(shí)驗(yàn)人員的操作技術(shù)和意識,避免在細(xì)胞培養(yǎng)過程中引入支原體污染。
3.使用無菌設(shè)備和耗材:使用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備和耗材,如無菌培養(yǎng)基、血清等,減少支原體污染的風(fēng)險(xiǎn)。
4. 定期消毒和清潔:對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行定期的消毒和清潔,包括工作臺、培養(yǎng)箱等,以減少支原體的潛在污染。
5. 使用預(yù)防性試劑:使用專門針對支原體的預(yù)防性試劑,如加入細(xì)胞培養(yǎng)基中的預(yù)防劑、超凈臺噴霧、水浴鍋預(yù)防和細(xì)胞培養(yǎng)箱水盤預(yù)防等,以預(yù)防支原體污染。
溫州支原體檢測服務(wù)細(xì)胞被支原體污染了會有什么影響?
方法
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靈敏度
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優(yōu)勢
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劣勢
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培養(yǎng)法
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☆☆☆
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ü 便捷
ü 便宜
ü 金標(biāo)準(zhǔn)
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ü 費(fèi)勞力
ü 耗時(shí)長
ü 需要特定的培養(yǎng)基
ü 特定支原體種類需要特定的培養(yǎng)基
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DNA染色
(DAPI or Hoescht)
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☆
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ü 迅速
ü 便捷
ü 便宜
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ü 可能難以判讀結(jié)果
ü 無法鑒別支原體種屬
ü 可能假陽性可能性
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間接染色
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☆☆☆
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ü 迅速
ü 便宜
ü 易檢測
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ü 費(fèi)時(shí)
ü 需要細(xì)胞系指示
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ELISA
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☆☆
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ü 迅速
ü 客觀,易判讀結(jié)果
ü 可以鑒別支原體種屬
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ü 受抗體限制
ü 價(jià)格高
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免疫染色
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☆☆
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ü 迅速
ü 可檢測支原體種屬
ü 價(jià)格略高
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ü 可檢測的支原體種屬有限
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放射自顯影
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☆☆
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ü 迅速
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ü 難以判讀結(jié)果
ü 無法鑒別支原體種屬
ü 費(fèi)勞力
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生物發(fā)光
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☆☆
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ü 迅速
ü 便捷
ü 便宜
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ü 難以判讀結(jié)果
ü 無法鑒別支原體種屬
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PCR
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☆☆☆
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ü 便宜
ü 迅速
ü 具有特異性
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ü 可能假陽性可能性
ü 檢測特異性依賴引物特異性
ü 需要提取DNA
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Real-Time PCR
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☆☆☆
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ü 便捷
ü 迅速
ü 具有特異性
ü 結(jié)果可靠
ü 高通量
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ü 可能假陽性可能性
ü 檢測特異性依賴引物特異性
ü 需要提取DNA
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LAMP
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☆☆
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ü 便捷
ü 無需DNA提取
ü *需10min左右的實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間
ü 具有特異性
ü 高通量
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ü 可能假陽性可能性
ü 檢測特異性依賴引物特異性
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細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的檢測方法有多種,以下是一些常用的檢測手段:
1. 顯微鏡檢測:通過相差顯微鏡觀察細(xì)胞,支原體在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間會呈現(xiàn)為暗色微小顆粒。
2. 熒光染色法:使用熒光染料Hoechst 33258與DNA特異性結(jié)合,使支原體的DNA著色,然后在熒光顯微鏡下觀察。染色后的支原體會在細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞膜表面顯示為亮綠色小點(diǎn)。
3. 電鏡檢查:使用掃描電鏡或透射電鏡觀察,這是一種簡便快速的方法。
4. 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):使用特定的引物對支原體DNA進(jìn)行擴(kuò)增,是一種高靈敏度的檢測方法。
5. 等溫?cái)U(kuò)增法:基于LAMP技術(shù),室溫反應(yīng)后觀察顏色變化確認(rèn)是否有支原體污染。
細(xì)胞培養(yǎng)為什么建議使用支原體檢測?
支原體去除試劑使用后,對支原體的檢測可能會有影響。一些支原體去除試劑通過特異性地與支原體膜結(jié)合、改變支原體膜的通透性來殺死支原體,而對真核細(xì)胞幾乎沒有影響。然而,某些情況下,去除試劑可能會對細(xì)胞的活力和形態(tài)產(chǎn)生一定的影響,尤其是在去除劑作用期間。此外,如果去除劑的效果不徹底,可能會導(dǎo)致細(xì)胞再次被支原體污染。
需要注意的是,某些支原體去除試劑可能會在去除支原體的過程中導(dǎo)致支原體膜溶解,從而釋放出支原體的DNA,這可能會在隨后的支原體核酸檢測中引起假陽性結(jié)果。因此,在去除支原體后,建議在繼續(xù)正常傳代培養(yǎng)幾代細(xì)胞后再進(jìn)行支原體檢測,以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
對于同一個(gè)樣品,為什么一步法恒溫試劑盒檢測結(jié)果為陽性,而PCR檢測為陰性呢?北京細(xì)胞培養(yǎng)支原體預(yù)防試劑
支原體污染如何預(yù)防?南京細(xì)胞培養(yǎng)支原體去除多少錢
細(xì)胞培養(yǎng)中支原體檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果可能由以下原因引起:
1. 擴(kuò)增產(chǎn)物污染:PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的大量DNA拷貝若未妥善處理,極微量的污染就可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
2. 引物設(shè)計(jì)不當(dāng):引物設(shè)計(jì)不夠特異性,可能會與非目標(biāo)序列發(fā)生反應(yīng),導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。
3. 試劑質(zhì)量問題:使用的dNTPs、引物、DNA聚合酶等試劑質(zhì)量不佳,可能引起非特異性擴(kuò)增或假陽性結(jié)果。
4. 操作技術(shù)問題:實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范,如混合樣本、標(biāo)簽錯(cuò)誤或樣本標(biāo)識不清等,可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
5. PCR反應(yīng)條件設(shè)置不當(dāng):不恰當(dāng)?shù)腜CR反應(yīng)條件,如溫度和時(shí)間選擇不當(dāng),可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。
6. DNA污染:PCR環(huán)境中的DNA污染會干擾結(jié)果,導(dǎo)致假陽性
南京細(xì)胞培養(yǎng)支原體去除多少錢