廣州Protein AG免疫沉淀實(shí)驗(yàn)視頻

來源: 發(fā)布時(shí)間:2024-06-10

Co-IP(免疫共沉淀)技術(shù)主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,其應(yīng)用場(chǎng)景如下:
1. 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的鑒定:Co-IP可用于構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的結(jié)合伙伴。
2. 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究:通過Co-IP技術(shù),科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了許多關(guān)鍵的細(xì)胞信號(hào)通路,如MAPK和PI3K/Akt通路等,為深入理解這些通路的功能和調(diào)控機(jī)制提供了重要線索。
3. 藥物靶點(diǎn)篩選:利用Co-IP技術(shù),研究人員可以篩選潛在的藥物靶點(diǎn)。
疾病機(jī)制研究:通過分析疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用,Co-IP有助于揭示疾病的分子機(jī)制。
4. 抗體藥物開發(fā):Co-IP可用于研究抗體藥物與其靶標(biāo)蛋白的結(jié)合特性,評(píng)估抗體藥物的親和力和特異性。
5. 轉(zhuǎn)錄因子研究:Co-IP技術(shù)可以用于研究轉(zhuǎn)錄因子與蛋白質(zhì)的相互作用,進(jìn)而揭示基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
免疫沉淀技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)?廣州Protein AG免疫沉淀實(shí)驗(yàn)視頻

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免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法??贵w與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后,再與蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶聯(lián)的珠子(agarose或Sepharose)孵育,通過離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物,沉淀經(jīng)過洗滌后,重懸于電泳上樣緩沖液,煮沸5-10min,在高溫及還原劑的作用下,抗原與抗體解離,離心收集上清,上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。免疫沉淀是一種生物學(xué)技術(shù),它利用抗體的特異性結(jié)合特性來富集和分離混合物中的特定蛋白質(zhì)。這種技術(shù)是研究蛋白質(zhì)表達(dá)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)修飾和蛋白質(zhì)功能的強(qiáng)大工具。蘇州anti Flag免疫沉淀磁珠應(yīng)用免疫沉淀技術(shù)RIP的優(yōu)缺點(diǎn)是什么?

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免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation,簡(jiǎn)稱IP)是一種生物化學(xué)方法,它利用特異性抗體對(duì)抗原進(jìn)行親和純化。在含有目的抗原的細(xì)胞裂解液中加入特定的抗體以及Protein A/G-Beads(預(yù)先將Protein A/G固定結(jié)合在磁珠上),根據(jù)抗原與抗體、Protein A/G與抗體的Fc的特異性,形成“抗原-抗體-Protein A/G-Beads”復(fù)合物,清洗離心后去除溶液中未結(jié)合的雜蛋白,檢測(cè)是否存在目的蛋白。
免疫沉淀技術(shù)常用于從細(xì)胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測(cè)或其他檢測(cè)技術(shù)的蛋白和其他生物分子。它的目標(biāo)是分離足夠用于Western Blot或其他檢測(cè)方法檢測(cè)的蛋白質(zhì)。

ChIP實(shí)驗(yàn)的基本步驟包括:
1. 交聯(lián)(Crosslinking):細(xì)胞被甲醛等交聯(lián)劑處理,使得蛋白質(zhì)和DNA之間的相互作用被固定,形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。
2. 細(xì)胞裂解:裂解細(xì)胞,釋放染色質(zhì),同時(shí)保持蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的完整性。
3. 超聲或酶解:通過超聲或酶解將染色質(zhì)切割成較小的片段,以便于后續(xù)步驟中的免疫沉淀。
4. 免疫沉淀(Immunoprecipitation):加入針對(duì)特定組蛋白修飾或轉(zhuǎn)錄因子的抗體,這些抗體會(huì)特異性地結(jié)合到目標(biāo)蛋白質(zhì)上。
5. 捕獲復(fù)合物:使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子捕獲抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。
6. 洗滌:洗滌珠子以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和DNA片段。
7. 逆轉(zhuǎn)錄交聯(lián):將捕獲的復(fù)合物從珠子上洗脫,并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄交聯(lián),使固定的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物分離。
8. DNA純化:純化從免疫沉淀中得到的DNA片段。
9. 分析:通過qPCR、芯片分析(ChIP-chip)或高通量測(cè)序(ChIP-seq)等方法分析沉淀的DNA片段,以確定特定蛋白質(zhì)在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)。
免疫沉淀技術(shù)ChIP的實(shí)驗(yàn)方法。

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免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)的實(shí)驗(yàn)步驟通常包括以下幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié):
1. 細(xì)胞裂解:首先需要收集細(xì)胞并裂解它們,以釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。這通常通過添加含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液來完成,以防止蛋白質(zhì)降解。
2. 裂解物上清:裂解后的細(xì)胞混合物通常需要通過離心來去除未破碎的細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞,從而獲得上清。
3. 抗體的添加:將特定于目標(biāo)蛋白的抗體加入到裂解物中。這些抗體將特異性地結(jié)合到目標(biāo)蛋白上。
4. 免疫復(fù)合物的形成:抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合形成免疫復(fù)合物。
5. 免疫復(fù)合物的捕獲:使用Protein A/G結(jié)合的磁珠來捕獲免疫復(fù)合物。
6. 洗滌:捕獲免疫復(fù)合物后,需要用裂解/洗滌緩沖液多次洗滌,以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他污染物。
7. 洗脫:免疫復(fù)合物可以通過加入SDS樣品緩沖液進(jìn)行洗脫,這將導(dǎo)致抗體和抗原變性并從珠子上釋放下來,或者使用低pH緩沖液進(jìn)行溫和洗脫,以保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。
8. 分析:洗脫后的樣品可以通過SDS-PAGE凝膠電泳、Western blot等方法進(jìn)行分析,以驗(yàn)證目標(biāo)蛋白的存在和狀態(tài)。
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免疫沉淀技術(shù)Co-IP的應(yīng)用有哪些?廣州Protein AG免疫沉淀實(shí)驗(yàn)視頻

免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)特性的重要方法。它具有一些明顯的優(yōu)點(diǎn),但也存在一些局限性。
優(yōu)點(diǎn):
1. 特異性強(qiáng):IP技術(shù)利用特異性抗體對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行捕獲,因此具有很高的特異性。
2. 富集低豐度蛋白:可以從小量樣本中富集低豐度的目標(biāo)蛋白,有助于研究稀有蛋白。
3. 研究蛋白質(zhì)相互作用:通過Co-IP等變體技術(shù),可以研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。
4. 操作簡(jiǎn)便:IP實(shí)驗(yàn)步驟相對(duì)簡(jiǎn)單,容易在實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施。

缺點(diǎn):
1. 對(duì)抗體質(zhì)量依賴性高:需要高質(zhì)量的特異性抗體,否則可能導(dǎo)致假陽性或?qū)嶒?yàn)失敗。
2. 存在非特異性結(jié)合:樣本中的其他蛋白質(zhì)可能非特異性地結(jié)合到抗體或固相載體上。
3. 可能破壞蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象:裂解和洗滌步驟可能破壞蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu),影響其功能。
4. 可能存在背景噪聲:非特異性結(jié)合可能導(dǎo)致背景噪聲,影響結(jié)果的清晰度和解釋。

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標(biāo)簽: 支原體 免疫沉淀