免疫沉淀技術(shù)的實驗設(shè)計通常包括以下幾個關(guān)鍵步驟:
1. 目標蛋白質(zhì)的選擇:
2. 抗體的選擇:選擇特異性強、親和力高的抗體來捕獲目標蛋白質(zhì)
3. 樣本的準備:收集和準備細胞或組織樣本。
4. 蛋白質(zhì)的裂解和釋放:選擇合適的裂解條件,如pH值、離子強度、去污劑等。
5. 蛋白質(zhì)濃度的測定:確定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度,以便于后續(xù)步驟的標準化。
6. 免疫沉淀的操作:將特異性抗體與裂解液混合,并在適宜的條件下孵育,以形成抗體-抗原復合物。
7. 非特異性結(jié)合的減少:通過預(yù)純化步驟去除可能的非特異性結(jié)合蛋白。
8. 洗滌:多次洗滌以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。
9. 目標蛋白質(zhì)的洗脫:使用適當?shù)木彌_液洗脫抗體-抗原復合物。
10. 后續(xù)分析:對洗脫的蛋白質(zhì)進行進一步分析,如Western Blot.
11. 對照實驗:設(shè)計適當?shù)恼龑φ蘸拓搶φ眨栽u估實驗的特異性和敏感性。
免疫沉淀技術(shù)ChIP的原理是什么?北京免疫沉淀實驗視頻
ChIP(染色質(zhì)免疫沉淀)實驗是一種用于研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的技術(shù)。以下是ChIP實驗的實驗方法概述:
1. 交聯(lián):將細胞與交聯(lián)劑(如1%甲醛)孵育,通常在室溫下進行10-15分鐘。
2. 終止交聯(lián):添加甘氨酸以終止交聯(lián)反應(yīng),孵育5分鐘。
3. 收集細胞:通過離心收集細胞,并用PBS洗滌以去除交聯(lián)劑。
4. 細胞裂解:使用裂解緩沖液裂解細胞,釋放染色質(zhì)。
5. 染色質(zhì)剪切:使用超聲波或酶消化將染色質(zhì)剪切成適當大小的片段。
6. 免疫沉淀:將剪切后的染色質(zhì)與特異性抗體孵育,然后添加蛋白A/G磁珠。
7. 洗滌:用低鹽、高鹽和LiCl洗滌液洗滌磁珠,去除非特異性結(jié)合物。
8. 洗脫:用洗脫緩沖液洗脫DNA。
9. 逆轉(zhuǎn)交聯(lián):用蛋白酶K處理,然后在65°C下加熱過夜以逆轉(zhuǎn)交聯(lián)。
10. DNA純化:使用商業(yè)試劑盒或標準酚/氯仿方法純化DNA。
11. 分析:使用qPCR分析富集的DNA,或進行測序以確定蛋白質(zhì)結(jié)合位點。
南京蛋白免疫沉淀技術(shù)服務(wù)免疫沉淀技術(shù)的實驗設(shè)計。
免疫沉淀技術(shù)的實驗方法通常包括以下步驟:
1. 樣本準備
2. 細胞裂解:使用裂解緩沖液(含有蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解)裂解細胞,釋放蛋白質(zhì)。
3. 蛋白質(zhì)濃度測定:使用BCA、Bradford或Lowry等方法測定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度。
4. 抗體預(yù)處理:如果使用預(yù)固定的抗體,需先將抗體固定在固相支持物上,如瓊脂糖珠或磁性微珠。
5. 免疫沉淀反應(yīng):將裂解液與特異性抗體(固定或未固定)混合,并在4°C下緩慢搖晃孵育過夜,以允許抗體與目標蛋白質(zhì)充分結(jié)合。
6. 固相支持物的回收:對于未固定的抗體,加入與抗體特異性結(jié)合的蛋白A或蛋白G結(jié)合的固相支持物。
7. 洗滌:去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì),通常需要多次洗滌固相支持物。
8. 洗脫:使用適當?shù)南疵摼彌_液(如加熱的SDS加載緩沖液或酸性緩沖液)從固相支持物上洗脫免疫復合物。
9. 后續(xù)分析:對洗脫的蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE電泳、Western Blot、質(zhì)譜分析等,以進一步分析目標蛋白質(zhì)。
10. 對照實驗:包括正對照(已知能沉淀目標蛋白的抗體)和負對照(非特異性抗體或無抗體)以驗證實驗的特異性。
免疫沉淀技術(shù)RIP(RNA Immunoprecipitation,RNA免疫沉淀)的實驗方法基于以下幾個關(guān)鍵步驟:
1. 細胞裂解:首先,細胞或組織樣本被裂解,以釋放細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和RNA復合物。
2.抗體特異性結(jié)合:裂解后的樣本中加入針對特定RNA結(jié)合蛋白的抗體。這些抗體能夠特異性地識別并結(jié)合到目標蛋白。
3. 免疫復合物形成:抗體與目標蛋白結(jié)合后,形成抗體-蛋白質(zhì)-RNA復合物。
4. 親和介質(zhì)捕獲:使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子(如瓊脂糖或磁性珠子)來捕獲這些抗體-蛋白質(zhì)-RNA復合物。蛋白A或蛋白G能夠與抗體的Fc部分結(jié)合,從而拉下與之結(jié)合的復合物。
5. 洗滌:捕獲的復合物被洗滌以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA。
6. RNA分離和分析:從珠子上洗脫或消化復合物,分離出RNA,并進行進一步的分析,如qPCR、Northern blot或高通量測序(RNA-Seq)。
免疫沉淀技術(shù)的綜述。
免疫沉淀技術(shù)RIP(RNA Immunoprecipitation,RNA免疫沉淀)是一種用于研究細胞內(nèi)RNA與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。RIP技術(shù)可以幫助我們了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)過程,并發(fā)現(xiàn)miRNA等非編碼RNA的調(diào)節(jié)靶點。
RIP技術(shù)的原理是利用針對特定RNA結(jié)合蛋白的抗體,將細胞內(nèi)的RNA-蛋白質(zhì)復合物沉淀下來。然后,可以通過分離純化,對這些復合物中的RNA進行檢測,如qPCR驗證或測序分析。
表觀遺傳學和RNA生物學領(lǐng)域?qū)Σ煌琑NA作用和功能的關(guān)注增加。RNA-蛋白質(zhì)相互作用能夠調(diào)控mRNA和非編碼RNA的功能。對RNA潛能的這一新認識帶動了新方法的發(fā)展,使研究人員能夠定位 RNA-蛋白質(zhì)相互作用。
免疫沉淀技術(shù)IP的原理是什么?IP免疫沉淀磁珠價格
免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用。北京免疫沉淀實驗視頻
免疫沉淀(Co-IP)實驗中抗體的選擇非常關(guān)鍵,因為抗體的特異性和親和力直接影響到實驗的成功與否。
1. 特異性:抗體應(yīng)當對目標蛋白具有高度的特異性,以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合,導致假陽性結(jié)果。
2. 親和力:抗體對目標蛋白的親和力要足夠高,以確保在免疫沉淀過程中能夠有效地捕獲目標蛋白。
3. 抗體類型:單克隆抗體和多克隆抗體都可以用于IP實驗。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性,而多克隆抗體可能提供更強的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗證:選擇已經(jīng)過免疫沉淀(Co-IP)或相關(guān)應(yīng)用(如Western blot, IHC)驗證的抗體,這增加了實驗成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息:選擇信譽良好的抗體供應(yīng)商,并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評價,以幫助做出決策。
北京免疫沉淀實驗視頻
上海世途科生物(CYTOCH)是一家生命科學上游工具類企業(yè)。聚焦于細胞生物學相關(guān)的化學技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)與生產(chǎn),產(chǎn)品覆蓋細胞培養(yǎng)產(chǎn)品如胎牛血清,支原體檢測,支原體去除試劑等,細胞轉(zhuǎn)染產(chǎn)品如轉(zhuǎn)染試劑,及細胞檢測產(chǎn)品如增殖凋亡檢測,報告基因等多個科研場景,給終端客戶提供良好的產(chǎn)品以及服務(wù)。
CYTOCH世途科生物正穩(wěn)步前行,致力于將自己打造成為全球客戶信賴的中國生命科學工具品牌,助力全球科研工作者在生命科學的探索之旅中不斷取得突破。