免疫沉淀純化所得抗原量低有多種原因,
A. 純化所得抗原量低
1. 抗原結(jié)合水平低
IP 應(yīng)用中出現(xiàn)低抗原結(jié)合水平的可能原因有很多,結(jié)合反應(yīng)所使用的溶液是重要原因之一。必須使用適合的緩沖液,有特定的pH和鹽濃度,可能還需要添加互作所需的輔助因子。IP 或Co-IP 中用于純化的抗體是影響得率的另一個(gè)重要因素。如果抗體本身易失活或與抗原結(jié)合微弱,則可能很難找到足夠溫和的條件,即能產(chǎn)生結(jié)合,又能保證在孵育和洗滌過程中結(jié)合可以穩(wěn)定保持。
2. 抗原洗脫水平低
在某些情況下,抗原與抗體或結(jié)合蛋白結(jié)合之間可能會(huì)發(fā)生極強(qiáng)的相互作用,傳統(tǒng)的洗脫緩沖液無法將其破壞。如果需要使用溫和洗脫緩沖液收集功能性抗原,則上述矛盾尤為突出。
免疫沉淀技術(shù)RIP是什么?上海免疫沉淀技術(shù)服務(wù)
免疫沉淀RIP實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實(shí)驗(yàn)情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu) (直徑 50-150 μm) 可以結(jié)合抗體 (繼而結(jié)合靶蛋白) ,它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體,而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu),這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸,具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同,磁珠是固體,抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ,盡管磁珠沒有多孔中心增加結(jié)合能力,但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多,使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。
簡而言之,瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng),而磁珠在得率,可重復(fù)性以及自動(dòng)化方面有明顯的優(yōu)勢。
上海免疫沉淀磁珠價(jià)格免疫沉淀技術(shù)RIP的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation,簡稱IP)是一種生物化學(xué)方法,它利用特異性抗體對抗原進(jìn)行親和純化。在含有目的抗原的細(xì)胞裂解液中加入特定的抗體以及Protein A/G-Beads(預(yù)先將Protein A/G固定結(jié)合在磁珠上),根據(jù)抗原與抗體、Protein A/G與抗體的Fc的特異性,形成“抗原-抗體-Protein A/G-Beads”復(fù)合物,清洗離心后去除溶液中未結(jié)合的雜蛋白,檢測是否存在目的蛋白。
免疫沉淀技術(shù)常用于從細(xì)胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測或其他檢測技術(shù)的蛋白和其他生物分子。它的目標(biāo)是分離足夠用于Western Blot或其他檢測方法檢測的蛋白質(zhì)。
RNA免疫沉淀技術(shù)(RIP)是一種研究RNA與蛋白質(zhì)相互作用的重要方法,其應(yīng)用領(lǐng)域主要包括:
1. 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究:RIP技術(shù)可以幫助研究者了解RNA在轉(zhuǎn)錄后水平如何被調(diào)控。
2. 表觀遺傳調(diào)控:RIP技術(shù)用于研究RNA結(jié)合蛋白(RBPs)在表觀遺傳調(diào)控中的作用。
3. 非編碼RNA功能研究:RIP技術(shù)可以用來研究長非編碼RNA(lncRNA)、miRNA和其他小RNA的種類,以及它們?nèi)绾闻c蛋白質(zhì)相互作用來調(diào)控基因表達(dá)。
4. RNA病毒研究:RIP技術(shù)也可用于研究RNA病毒與其宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用,進(jìn)而了解病毒復(fù)制和致病機(jī)制。
5. RNA修飾和甲基化研究:RIP技術(shù)結(jié)合其他技術(shù)如m5C-RIP-seq,可用于研究RNA甲基化修飾及其在病理過程中的作用。
6. RNA定位和穩(wěn)定性:通過RIP技術(shù),研究者可以探索特定RNA在細(xì)胞內(nèi)的定位以及它們?nèi)绾伪环€(wěn)定或降解。
7. RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的鑒定:RIP技術(shù)可以用來鑒定與特定RNA結(jié)合的蛋白質(zhì),從而揭示RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成。
8. 疾病相關(guān)RNA研究:RIP技術(shù)在疾病相關(guān)RNA的研究中也有應(yīng)用。
免疫沉淀樣本的制備。
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)的實(shí)驗(yàn)步驟通常包括以下幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié):
1. 細(xì)胞裂解:首先需要收集細(xì)胞并裂解它們,以釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。這通常通過添加含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液來完成,以防止蛋白質(zhì)降解。
2. 裂解物上清:裂解后的細(xì)胞混合物通常需要通過離心來去除未破碎的細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞,從而獲得上清。
3. 抗體的添加:將特定于目標(biāo)蛋白的抗體加入到裂解物中。這些抗體將特異性地結(jié)合到目標(biāo)蛋白上。
4. 免疫復(fù)合物的形成:抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合形成免疫復(fù)合物。
5. 免疫復(fù)合物的捕獲:使用Protein A/G結(jié)合的磁珠來捕獲免疫復(fù)合物。
6. 洗滌:捕獲免疫復(fù)合物后,需要用裂解/洗滌緩沖液多次洗滌,以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他污染物。
7. 洗脫:免疫復(fù)合物可以通過加入SDS樣品緩沖液進(jìn)行洗脫,這將導(dǎo)致抗體和抗原變性并從珠子上釋放下來,或者使用低pH緩沖液進(jìn)行溫和洗脫,以保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。
8. 分析:洗脫后的樣品可以通過SDS-PAGE凝膠電泳、Western blot等方法進(jìn)行分析,以驗(yàn)證目標(biāo)蛋白的存在和狀態(tài)。
免疫沉淀技術(shù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。上海IP免疫沉淀磁珠的選擇
免疫沉淀技術(shù)Co-IP的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。上海免疫沉淀技術(shù)服務(wù)
ChIP(染色質(zhì)免疫沉淀)實(shí)驗(yàn)是一種用于研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的技術(shù)。以下是ChIP實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概述:
1. 目標(biāo)蛋白的選擇:確定您想要研究的目標(biāo)蛋白,例如特定的轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾。
2. 樣本的準(zhǔn)備:根據(jù)研究的需要選擇合適的細(xì)胞或組織樣本。
3. 抗體的選擇:選擇具有高特異性和親和力的抗體,這對于實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。
4. 交聯(lián):使用甲醛等交聯(lián)劑將蛋白質(zhì)與DNA在體內(nèi)共價(jià)結(jié)合,形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。
5. 細(xì)胞裂解:裂解細(xì)胞以釋放染色質(zhì),同時(shí)保持蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的完整性。
6. 染色質(zhì)的剪切:通過超聲或酶消化將染色質(zhì)剪切成適當(dāng)大小的片段,通常在200-1000 bp之間。
7. 免疫沉淀:使用特定抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合,然后利用蛋白A/G磁珠沉淀復(fù)合物。
8. 洗滌和洗脫:洗滌沉淀物以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和DNA,然后洗脫目標(biāo)蛋白-DNA復(fù)合物。
9. 逆轉(zhuǎn)交聯(lián):使用蛋白酶K處理樣品以逆轉(zhuǎn)交聯(lián),釋放DNA。
10. DNA的純化和分析:純化DNA并使用qPCR、芯片或測序技術(shù)(如ChIP-seq)進(jìn)行分析。
上海免疫沉淀技術(shù)服務(wù)
在CYTOCH的理念中,化學(xué)與生物的結(jié)合是提升產(chǎn)品性能的關(guān)鍵。化學(xué)技術(shù)的進(jìn)步為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了更多的可能性,使得相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為靈敏、準(zhǔn)確。為了在細(xì)胞研究領(lǐng)域取得技術(shù)性突破,CYTOCH研發(fā)團(tuán)隊(duì)不斷嘗試將新型的化學(xué)技術(shù)與生物技術(shù)相融合。CYTOCH在細(xì)胞領(lǐng)域所進(jìn)行的已有技術(shù)的持續(xù)突破、新技術(shù)的創(chuàng)新研發(fā)、化學(xué)與生物技術(shù)的不斷碰撞結(jié)合,使得CYTOCH產(chǎn)品在臨床診斷、藥物研發(fā)和科研教育等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景。
在保證研發(fā)驅(qū)動(dòng)力的前提下,為確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定與可靠以及產(chǎn)品的使用性,CYTOCH對原料供應(yīng)商進(jìn)行嚴(yán)格審計(jì)和把關(guān),選擇品質(zhì)優(yōu)良的原料進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)品生產(chǎn)。 在生產(chǎn)過程中,CYTOCH對生產(chǎn)人員資質(zhì)、生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)過程、生產(chǎn)物料進(jìn)行嚴(yán)格把控。后續(xù)的產(chǎn)品質(zhì)檢、入庫出庫均嚴(yán)格按照企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)由質(zhì)量和倉庫物流人員進(jìn)行層層把關(guān),確保每一批出廠產(chǎn)品質(zhì)量都處于行業(yè)前端水平。