免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實(shí)驗(yàn)情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu) (直徑 50-150 μm) 可以結(jié)合抗體 (繼而結(jié)合靶蛋白) ,它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體,而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu),這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸,具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同,磁珠是固體,抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ,盡管磁珠沒有多孔中心增加結(jié)合能力,但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多,使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。
簡而言之,瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng),而磁珠在得率,可重復(fù)性以及自動化方面有明顯的優(yōu)勢。
免疫沉淀技術(shù)IP的實(shí)驗(yàn)方法。深圳anti DYKDDDDK免疫沉淀實(shí)驗(yàn)原理
RIP 技術(shù)的原理(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀)主要是運(yùn)用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來,經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證或者測序分析。
RIP 是研究細(xì)胞內(nèi)RNA 與蛋白結(jié)合情況的技術(shù),是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用,但由于研究對象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物,RIP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗(yàn)不太相同,如:RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體不能含有RNA酶,抗體需經(jīng)RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等等。
上海免疫沉淀磁珠多少錢免疫沉淀抗體的選擇?
免疫沉淀實(shí)驗(yàn)步驟:
1. 樣品制備
a. 懸浮細(xì)胞樣品處理:離心收集細(xì)胞(4℃, 1000g, 5 min),用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液(裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail,使蛋白酶抑制劑Cocktail的終濃度為1×)?;靹蚝笾糜诒咸幚?0 min;離心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。
b. 貼壁細(xì)胞樣品處理:移去培養(yǎng)基,用PBS清洗細(xì)胞兩遍;用細(xì)胞刮棒刮脫細(xì)胞,收集至1.5mL EP管內(nèi),按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液(裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail,使蛋白酶抑制劑Cocktail的終濃度為1×)。吹打數(shù)下,使裂解液和細(xì)胞充分接觸?;靹蚝笾糜诒咸幚?0 min;離心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。
4. 后續(xù):磁珠預(yù)處理——抗體吸附——抗原結(jié)合反應(yīng)——抗體洗脫
免疫沉淀純化所得抗原量低有多種原因,
A. 純化所得抗原量低
1. 抗原結(jié)合水平低
IP 應(yīng)用中出現(xiàn)低抗原結(jié)合水平的可能原因有很多,結(jié)合反應(yīng)所使用的溶液是重要原因之一。必須使用適合的緩沖液,有特定的pH和鹽濃度,可能還需要添加互作所需的輔助因子。IP 或Co-IP 中用于純化的抗體是影響得率的另一個(gè)重要因素。如果抗體本身易失活或與抗原結(jié)合微弱,則可能很難找到足夠溫和的條件,即能產(chǎn)生結(jié)合,又能保證在孵育和洗滌過程中結(jié)合可以穩(wěn)定保持。
2. 抗原洗脫水平低
在某些情況下,抗原與抗體或結(jié)合蛋白結(jié)合之間可能會發(fā)生極強(qiáng)的相互作用,傳統(tǒng)的洗脫緩沖液無法將其破壞。如果需要使用溫和洗脫緩沖液收集功能性抗原,則上述矛盾尤為突出。
免疫沉淀技術(shù)Co-IP的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,ChIP)技術(shù)是目前公認(rèn)的研究此相互作用的選擇,是真核生物基因表達(dá)機(jī)制研究中不可或缺的技術(shù)之一。
它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下,固定蛋白質(zhì)-DNA(染色質(zhì))復(fù)合物,并將其切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過免疫學(xué)方法(抗體親和)沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA,通過對目的片段的純化與后期檢測,從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA 相互作用的信息。
這項(xiàng)技術(shù)通過蛋白質(zhì)與DNA互作來分析目標(biāo)基因活性以及已知蛋白質(zhì)的靶基因,被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與靶基因啟動子上特異核苷酸序列結(jié)合方面的研究。該技術(shù)常與DNA芯片和分子克隆技術(shù)相結(jié)合。
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免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)是一種利用抗體與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的特性,從復(fù)雜樣本中分離和純化目標(biāo)蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法。這項(xiàng)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用場景,以下是一些主要的應(yīng)用領(lǐng)域:
1. 蛋白質(zhì)相互作用分析:通過免疫沉淀技術(shù),研究人員可以研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,揭示蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成以及它們在細(xì)胞內(nèi)的功能和調(diào)控機(jī)制。
2. 抗體藥物開發(fā):免疫沉淀技術(shù)可以用于研究抗體藥物與其靶標(biāo)蛋白的結(jié)合特性,評估抗體藥物的親和力和特異性,指導(dǎo)抗體藥物的設(shè)計(jì)和優(yōu)化。
3. 蛋白質(zhì)表達(dá)水平分析:通過比較不同條件下的免疫沉淀結(jié)果,可以評估目標(biāo)蛋白的相對量,進(jìn)而研究蛋白質(zhì)的表達(dá)調(diào)控。
4. 染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP):這是一種特殊的免疫沉淀技術(shù),用于研究蛋白質(zhì)與DNA的相互作用,如轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾與基因組特定區(qū)域的結(jié)合情況。
5. RNA免疫沉淀(RIP):類似于ChIP,RIP用于研究RNA結(jié)合蛋白與RNA分子之間的相互作用。
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世途科生物簡介:
上海世途科生物科技有限公司是一家集研發(fā)、生產(chǎn)、銷售于一體的,為全球用戶提供生物試劑的生命科學(xué)企業(yè)。世途科生物(CYTOCH)匯集了一支由海內(nèi)外KOL組成的研發(fā)團(tuán)隊(duì),他們在生物和化學(xué)領(lǐng)域擁有相當(dāng)豐富的研發(fā)經(jīng)驗(yàn),通過將化學(xué)與生物技術(shù)相結(jié)合,致力于現(xiàn)有技術(shù)難點(diǎn)突破、新技術(shù)研究,為相關(guān)科學(xué)研究者提供思路和解決辦法。
憑借著強(qiáng)大的研發(fā)實(shí)力和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量管理,通過產(chǎn)學(xué)研合作,加快客戶科研成果的轉(zhuǎn)化,不斷推動行業(yè)的發(fā)展。