PDX-1免疫組化

熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比，成本較低。間接免疫熒光的缺點(diǎn)：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加；與直接免疫熒光相比，時(shí)間更長(zhǎng)（操作步驟更多）。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大；與直接免疫熒光相比，通過信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度；熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比，成本較低。間接免疫熒光的缺點(diǎn)：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加；與直接免疫熒光相比，時(shí)間更長(zhǎng)（操作步驟更多）。免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用。PDX-1免疫組化

熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長(zhǎng)為490--495nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長(zhǎng)為570nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm，呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長(zhǎng)為550nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。bcl-2免疫熒光染色免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附。

免疫熒光通過抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)抗原所在的細(xì)胞或組織進(jìn)行定性或定量。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，利用定量技術(shù)測(cè)定含量，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析。細(xì)胞免疫熒光用途：快速直觀顯示所檢測(cè)蛋白的細(xì)胞定位。材料與儀器：樣品：貼壁細(xì)胞；試劑：4% 組織固定液，PBS，Triton X-100，BSA，熒光二抗，免疫熒光染色二抗稀釋液，抗熒光猝滅封片液，0.25% 胰酶；器材：6/12/24 孔板，細(xì)胞爬片（蓋玻片），載玻片，15 ml 離心管。

免疫熒光檢測(cè)相對(duì)于酶檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)：定量熒光信號(hào)的能力（與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測(cè)定相反）；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測(cè)多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。

細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實(shí)現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量，首先應(yīng)建立針對(duì)目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究，同時(shí)將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部，標(biāo)記目的靶點(diǎn)。封閉細(xì)胞樣品，防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合，較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。bcl-2免疫熒光染色

熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。PDX-1免疫組化

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：根據(jù)所檢測(cè)抗原所在位置來確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測(cè)抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透；一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時(shí)間，1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色：烤片溫度過高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過低，孵育是否時(shí)間過短等。PDX-1免疫組化