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免疫熒光通過(guò)抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng),進(jìn)而對(duì)抗原所在的細(xì)胞或組織進(jìn)行定性或定量。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出,熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光,可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織,利用定量技術(shù)測(cè)定含量,從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析。細(xì)胞免疫熒光用途:快速直觀顯示所檢測(cè)蛋白的細(xì)胞定位。材料與儀器:樣品:貼壁細(xì)胞;試劑:4% 組織固定液,PBS,Triton X-100,BSA,熒光二抗,免疫熒光染色二抗稀釋液,抗熒光猝滅封片液,0.25% 胰酶;器材:6/12/24 孔板,細(xì)胞爬片(蓋玻片),載玻片,15 ml 離心管。免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點(diǎn)和作用機(jī)制。CK19免疫抗體
細(xì)胞免疫熒光步驟對(duì)大家來(lái)說(shuō)一定是很陌生的,他是一種抗原抗體反應(yīng),好像對(duì)我們來(lái)說(shuō)他顯得很遙遠(yuǎn)的樣子,因?yàn)槲覀儾⒉涣私馑茏鍪裁?,通過(guò)這種技術(shù)可以讓我們對(duì)抗原或抗體的性質(zhì)、定位一次來(lái)分析出更多的數(shù)據(jù)。細(xì)胞免疫熒光,這對(duì)很多人來(lái)說(shuō)都是一次聽(tīng)說(shuō)這個(gè)東西,也不知道他對(duì)我們會(huì)有什么好處與壞處,科學(xué)研究就是這樣子的,普通老百姓是不會(huì)明白其中的道理的,但是這些研究也是確實(shí)的在我們的生活中取得了成果,能夠讓大家過(guò)的更加舒適。VEGF免疫組化免疫熒光技術(shù)可以用于研究遺傳疾病和基因表達(dá)調(diào)控。
注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行.DAPI復(fù)染核:爬片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。封片:爬片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照:切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(DAPI紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm,發(fā)射波長(zhǎng)420nm,發(fā)藍(lán)光;FITC激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm,發(fā)射波長(zhǎng)515-555nm,發(fā)綠光;CY3激發(fā)波長(zhǎng)510-560,發(fā)射波長(zhǎng)590nm,發(fā)紅光)。兩種抗體同時(shí)孵育:由于FIT容易萃滅,因此在孵育抗體時(shí)后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。
免疫熒光的原理:免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí),只要知道其中的一個(gè)因素,就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體,直接加在抗原標(biāo)本上,經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色,用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體,室溫下干燥后封片、鏡檢。免疫熒光技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)分子,通過(guò)不同顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。
免疫熒光應(yīng)用范圍:其應(yīng)用范圍極其普遍,可以測(cè)定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類(lèi)別,又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、藥物檢測(cè)、免疫學(xué)、血型鑒定等。許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱(chēng)為免疫熒光色素或熒光染料。異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,較大吸收光波長(zhǎng)為490495nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。免疫熒光技術(shù)是基于免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的重要方法之一。VEGF免疫組化
免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。CK19免疫抗體
zo-1的免疫熒光,步驟如下:1.細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)融合到95%-100%時(shí),從孵箱中取出。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次,每次10分鐘。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。4.1×PBS洗3次,每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘。6.1×PBS洗3次,每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘。8.加一抗(用1%BSA稀釋?zhuān)┓旁跐窈欣铮?度過(guò)夜。9.1×PBS洗3次,每次10分鐘。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘,閉光。11.1×PBS洗3次,每次10分鐘。12.95%甘油封片。注:4%甲醛,0.2%Triton,5%BSA均用1×PBS稀釋。CK19免疫抗體