OPG免疫熒光

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進行標記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)熒光抗體法是利用熒光標記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。OPG免疫熒光

細胞的固定及免疫熒光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗，37℃，室溫避光孵育1小時。注意二抗帶有熒光素標記，因此操作過程盡量在暗處進行。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst復(fù)染細胞核，一般為藍色熒光；避光孵育5-10min。使用PBS輕洗細胞3 次，每次 5 min，洗去多余的DAPI。取爬片時由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大，可將注射器針頭針尖向背面做個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，注意選擇抗體對應(yīng)的激發(fā)光源。MAP2免疫熒光分析在1941年，Coons初次成功地使用熒光素作為標記物質(zhì)進行免疫熒光實驗。

基于熒光成像的技術(shù)對于查詢細胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用。當(dāng)與免疫化學(xué)結(jié)合時，熒光成像技術(shù)的分析能力增加，增強了這種技術(shù)在普遍的研究和臨床應(yīng)用中的實用性，使其成為寶貴的工具。免疫熒光顯微鏡通過使活細胞成像能夠可視化整個細胞器，徹底改變了細胞生物學(xué)領(lǐng)域。免疫組織化學(xué)和免疫細胞化學(xué)是結(jié)合抗原抗體結(jié)合能力進行細胞分析的常用熒光成像技術(shù)。免疫熒光（IF）是一種強大的免疫染色技術(shù)，利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標分子結(jié)合的熒光素標記抗體。免疫熒光用于鑒定細胞中的細胞和組織特異性抗原；可視化蛋白質(zhì)的存在與否、細胞定位和活化狀態(tài)；并分析免疫反應(yīng)。

細胞免疫熒光實驗注意事項：1、建議細胞直接種孔板，采用倒置熒光顯微鏡拍照，這樣可以避免然后挑片時造成劃片或細胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果；2、若實驗室只有正置熒光顯微鏡，則需要將細胞植于細胞爬片。建議直接購買處理過的細胞爬片；若只有普通細胞爬片，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜，若用酸浸泡過夜，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟。然后，用洗潔精搓洗爬片，然后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干，再將爬片置于超凈臺造紫外消毒后備用。熒光抗體技術(shù)可以用于檢測和定位細胞或組織中的特定抗原物質(zhì)。

細胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘。7. 一抗，4度過夜，一般要大于18小時或者37度，1-2小時。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。OPG免疫熒光

免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標記的抗體與目標分子結(jié)合，從而實現(xiàn)可視化檢測。OPG免疫熒光

免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10min到數(shù)小時，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。OPG免疫熒光