osteocalcin(ocn)免疫熒光檢查

免疫熒光間接法測抗體實驗步驟：滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本，覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時振蕩。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。重復(fù)操作3。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。osteocalcin(ocn)免疫熒光檢查

細(xì)胞免疫熒光實驗注意事項：1、建議細(xì)胞直接種孔板，采用倒置熒光顯微鏡拍照，這樣可以避免然后挑片時造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果；2、若實驗室只有正置熒光顯微鏡，則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片。建議直接購買處理過的細(xì)胞爬片；若只有普通細(xì)胞爬片，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強(qiáng)，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜，若用酸浸泡過夜，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟。然后，用洗潔精搓洗爬片，然后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干，再將爬片置于超凈臺造紫外消毒后備用。CD68免疫熒光分析使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見的操作步驟。

細(xì)胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘。7. 一抗，4度過夜，一般要大于18小時或者37度，1-2小時。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時。

熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比，成本較低。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加；與直接免疫熒光相比，時間更長（操作步驟更多）。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號放大；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度；熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比，成本較低。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加；與直接免疫熒光相比，時間更長（操作步驟更多）。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。

免疫熒光間接法測抗體實驗注意事項：1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，會使熒光減弱。2）每次試驗時，需設(shè)置以下三種對照：①陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。熒光抗體技術(shù)可用于檢測和定位各種抗原，也可以用于檢測和定位抗體。osteocalcin(ocn)免疫熒光檢查

使用已知熒光抗原標(biāo)記物質(zhì)來檢查相應(yīng)抗體的方法被稱為熒光抗原技術(shù)。osteocalcin(ocn)免疫熒光檢查

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意：有的時候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來。洗的時候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時，感覺前者效果好，PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(避光)，或者37度1半小時，PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核，然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因為甘油不象樹脂那樣會干，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂。osteocalcin(ocn)免疫熒光檢查