杭州微流控芯片數(shù)字PCR如何選型

數(shù)字PCR也叫DigitalPCR（dPCR），是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種核酸定量分析技術(shù)。相較于傳統(tǒng)熒光定量PCR來(lái)說(shuō)，數(shù)字PCR對(duì)結(jié)果的判定不依賴于擴(kuò)增曲線循環(huán)Ct值，不受擴(kuò)增效率的影響，能夠直接讀出DNA的分子個(gè)數(shù)，能夠?qū)ζ鹗紭颖竞怂岱肿?**定量。數(shù)字PCR基本原理是將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬(wàn)份，然后再將其分配到不同的反應(yīng)單元中，使每個(gè)微滴單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的核酸分子（即DNA模板），每個(gè)單元都會(huì)對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行擴(kuò)增，然后再對(duì)每個(gè)單元進(jìn)行熒光信號(hào)的統(tǒng)計(jì)并計(jì)算。相對(duì)而言，傳統(tǒng)PCR或qPCR反應(yīng)都是發(fā)生于同一體系當(dāng)中，這也是數(shù)字PCR與其比較大的區(qū)別。檢測(cè)數(shù)量一次可達(dá)96個(gè)樣品。杭州微流控芯片數(shù)字PCR如何選型

要了解為什么傳統(tǒng)PCR存在限制，務(wù)必要了解PCR反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生了什么。基本PCR運(yùn)行可以分為三個(gè)階段：指數(shù)期每個(gè)循環(huán)積聚的產(chǎn)物準(zhǔn)確加倍（假定**反應(yīng)效率）。該反應(yīng)具有高度特異性和精確度。出現(xiàn)指數(shù)式擴(kuò)增，因?yàn)樗性噭┚迈r可用，反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)推動(dòng)反應(yīng)有利于擴(kuò)增子加倍。線性期（高變異性）隨著反應(yīng)繼續(xù)，一些試劑因擴(kuò)增而被消耗。反應(yīng)開(kāi)始減緩，并且每個(gè)循環(huán)的PCR產(chǎn)物不再加倍。平臺(tái)期（終點(diǎn)：使用傳統(tǒng)方法進(jìn)行凝膠檢測(cè)）反應(yīng)停止，不再產(chǎn)生更多產(chǎn)物，并且如果放置時(shí)間夠長(zhǎng)，PCR產(chǎn)物將開(kāi)始降解。因?yàn)槊總€(gè)樣品具有不同的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，所以每支試管或每個(gè)反應(yīng)將在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入平臺(tái)期。在平臺(tái)期可以看到這些差異。在平臺(tái)期內(nèi)，傳統(tǒng)PCR進(jìn)行測(cè)量，又稱為終點(diǎn)檢測(cè)。廣州廣州永諾數(shù)字PCR品牌流式檢測(cè)，順序逐一檢測(cè)每個(gè)微滴，無(wú)熒光交叉干擾，微滴陰性陽(yáng)性判讀準(zhǔn)確。

研究方向基因表達(dá)差異研究檢測(cè)時(shí)完全不依賴傳統(tǒng)的Ct值即可實(shí)現(xiàn)真正意義上的***定量，從而提供了比實(shí)時(shí)熒光定量PCR更精確的基因差異表達(dá)研究，尤其對(duì)于那些靶基因表達(dá)差異微小的情況：microRNA、lncRNAs等的表達(dá)分析、等位基因的不平衡表達(dá)、單細(xì)胞基因表達(dá)分析、Exosome內(nèi)核酸分子定量分析等。拷貝數(shù)變異(CNV)研究微滴化的樣品處理及檢測(cè)，這種擺脫Ct值的計(jì)算方法而直接獲取目標(biāo)基因的***拷貝數(shù)，為拷貝數(shù)變異的研究提供了***的檢測(cè)精度。是其他諸如二代測(cè)序、芯片雜交等平臺(tái)無(wú)法達(dá)到的，因此采用數(shù)字PCR能夠有效對(duì)NGS、aCGH的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并具有成本低、通量高的特點(diǎn)。

dPCR的基本原理目前dPCR主要有兩種形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒(méi)有模板的反應(yīng)器就沒(méi)有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度?？梢允褂脦追N不同的方法來(lái)分配樣品，包括微孔板，毛細(xì)管，油乳劑和帶有核酸結(jié)合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過(guò)假設(shè)分子種群遵循泊松分布來(lái)估計(jì)不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)可以通過(guò)公式A=-ln[(N-X)/N]*N計(jì)算，從而解決了多個(gè)目標(biāo)分子存在于單個(gè)液滴中的可能性。線性范圍達(dá)到6個(gè)數(shù)量級(jí)，靈敏度高達(dá)萬(wàn)分之一。

目前數(shù)字PCR技術(shù)在臨床領(lǐng)域已經(jīng)有著非常***且***地應(yīng)用，例如在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用：HBV檢測(cè)、HIV檢測(cè)、甲型流感病毒檢測(cè)等；在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用：13/18/21號(hào)染色體三倍體檢測(cè)、遺傳性耳聾檢測(cè)、地中海貧血檢測(cè)及優(yōu)生五項(xiàng)的病毒檢測(cè)等；在**靶向***相關(guān)基因檢測(cè)中的應(yīng)用：肺*EGFR基因突變、ALK基因融合檢測(cè)、結(jié)直腸*KRAS、BRAF基因突變檢測(cè)、乳腺*HER2基因 擴(kuò)增檢測(cè)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤IDH基因突變檢測(cè)等。以**靶向***相關(guān)基因檢測(cè)為例，在**形成的超早期,會(huì)出現(xiàn)**細(xì)胞的壞死和凋亡,這些凋亡或壞死的**細(xì)胞會(huì)釋放其DNA進(jìn)入外周血,因此通過(guò)分析循環(huán)血液中是否含有**特異的游離DNA就可以達(dá)到**早期篩查的目的。然而此時(shí)DNA含量極低,對(duì)檢測(cè)的靈敏度和精確性要求極高，目前只有數(shù)字PCR技術(shù)可以檢測(cè)出來(lái)。另外進(jìn)行個(gè)體化***時(shí),需要對(duì)基因組樣本進(jìn)行分析,此時(shí)利用數(shù)字PCR技術(shù)也能**提高結(jié)果的可信性,進(jìn)而建立合理***方案。采用微滴式技術(shù)高達(dá)100,000個(gè)的微滴。蘇州MicroDrop-100數(shù)字PCR報(bào)價(jià)

轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)（國(guó)標(biāo)）。杭州微流控芯片數(shù)字PCR如何選型

二代測(cè)序輔助建庫(kù)目前靶向測(cè)序建庫(kù)方法包括擴(kuò)增子方法，在均相溶液中，當(dāng)擴(kuò)增引物增加時(shí)，由于擴(kuò)增引物之間的相互作用，從而影響擴(kuò)增的效率;如果將其分散到大量微液滴中擴(kuò)增，將可降低引物間相互作用，提高擴(kuò)增效率。同時(shí)還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于少量模板的有效擴(kuò)增，得到更多的有效測(cè)序數(shù)據(jù)。CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果驗(yàn)證CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明，是基因編輯技術(shù)的一大突破，但如何驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是否成功，仍需要高靈敏度的檢測(cè)方法，數(shù)字PCR技術(shù)可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團(tuán)隊(duì)發(fā)明了以CRISPR為基礎(chǔ)的SHERLOCK技術(shù)可以對(duì)核酸進(jìn)行高靈敏度的定性檢測(cè)，但精確定量評(píng)估時(shí)仍采取了數(shù)字PCR進(jìn)行確認(rèn)。杭州微流控芯片數(shù)字PCR如何選型

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