杭州JUE對(duì)定量數(shù)字PCR原理

       要了解為什么傳統(tǒng) PCR 存在限制，務(wù)必要了解 PCR 反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生了什么。基本 PCR 運(yùn)行可以分為三個(gè)階段：

指數(shù)期

       每個(gè)循環(huán)積聚的產(chǎn)物準(zhǔn)確加倍（假定 ** 反應(yīng)效率）。該反應(yīng)具有高度特異性和精確度。出現(xiàn)指數(shù)式擴(kuò)增，因?yàn)樗性噭┚迈r可用，反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)推動(dòng)反應(yīng)有利于擴(kuò)增子加倍。

線性期（高變異性）

       隨著反應(yīng)繼續(xù)，一些試劑因擴(kuò)增而被消耗。反應(yīng)開(kāi)始減緩，并且每個(gè)循環(huán)的 PCR 產(chǎn)物不再加倍。

平臺(tái)期（終點(diǎn)：使用傳統(tǒng)方法進(jìn)行凝膠檢測(cè)）

       反應(yīng)停止，不再產(chǎn)生更多產(chǎn)物，并且如果放置時(shí)間夠長(zhǎng)，PCR 產(chǎn)物將開(kāi)始降解。因?yàn)槊總€(gè)樣品具有不同的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，所以每支試管或每個(gè)反應(yīng)將在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入平臺(tái)期。在平臺(tái)期可以看到這些差異。在平臺(tái)期內(nèi)，傳統(tǒng) PCR 進(jìn)行測(cè)量，又稱(chēng)為終點(diǎn)檢測(cè)。 不依賴(lài)Ct值，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線。杭州JUE對(duì)定量數(shù)字PCR原理

dPCR的基本原理

       目前dPCR主要有兩種形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒(méi)有模板的反應(yīng)器就沒(méi)有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度?？梢允褂脦追N不同的方法來(lái)分配樣品，包括微孔板，毛細(xì)管，油乳劑和帶有核酸結(jié)合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過(guò)假設(shè)分子種群遵循泊松分布來(lái)估計(jì)不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)可以通過(guò)公式A=-ln[(N-X)/N]*N計(jì)算，從而解決了多個(gè)目標(biāo)分子存在于單個(gè)液滴中的可能性。 常州廣州永諾數(shù)字PCR解決方案準(zhǔn)確度不完全依賴(lài)于擴(kuò)增效率。

       在定量PCR時(shí)，我們常常糾結(jié)一個(gè)問(wèn)題，究竟是相對(duì)定量還是***定量呢？如今，你無(wú)需糾結(jié)了，因?yàn)閿?shù)字PCR（digital PCR）來(lái)了。盡管這兩種技術(shù)有些類(lèi)似，都是估計(jì)起始樣品中的核酸量，但它們有一個(gè)重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因來(lái)測(cè)定核酸量，而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的***定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究（如等位基因不平衡表達(dá)）、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。

       數(shù)字PCR可以直接計(jì)算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，因此無(wú)需依賴(lài)于對(duì)照樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進(jìn)行精確的***定量檢測(cè)；此外，由于數(shù)字PCR在進(jìn)行結(jié)果判讀時(shí)*判斷有/無(wú)兩種擴(kuò)增狀態(tài)，因此也不需要檢測(cè)熒光信號(hào)與設(shè)定閾值線的交點(diǎn)，完全不依賴(lài)于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響**降低，對(duì)PCR反應(yīng)***物的耐受能力**提高；數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分配的過(guò)程可以極大程度上降低與目標(biāo)序列有競(jìng)爭(zhēng)性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復(fù)雜背景中檢測(cè)稀有突變。支持多重?cái)?shù)字PCR，可選全中文分析軟件。

       CNV（Copy Number Variations，拷貝數(shù)變異）研究需要極高的定量精度以區(qū)別不同拷貝數(shù)之間的微小差異，測(cè)序方法適用于高于30%的變異率檢測(cè)，而qPCR的比較**辨在1.5倍左右，數(shù)字PCR通過(guò)直接計(jì)數(shù)目標(biāo)基因與參照基因( 拷貝數(shù)為1的基因，例如RNaseP) 的數(shù)目，計(jì)算比值，直接得到目標(biāo)基因的拷貝數(shù)可以達(dá)到極高的拷貝數(shù)分辨精度。

       除此之外，dPCR在病原微生物檢測(cè)、microRNA研究、基因表達(dá)研究、NGS測(cè)序文庫(kù)的***定量、表觀遺傳學(xué)直接相關(guān)的DNA甲基化定量檢測(cè)、ChIP定量鑒定等領(lǐng)域的應(yīng)用都令人極為期待，而在轉(zhuǎn)基因成分鑒定、分子標(biāo)準(zhǔn)品精確定量、環(huán)境樣本檢測(cè)等具體的應(yīng)用方向上，已經(jīng)有大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果證明了dPCR技術(shù)的優(yōu)良性能。

數(shù)字PCR技術(shù)是公認(rèn)的液體活檢領(lǐng)域靈敏度比較好的檢測(cè)方法。杭州JUE對(duì)定量數(shù)字PCR原理

單次微滴生成*需2分鐘。杭州JUE對(duì)定量數(shù)字PCR原理

定量PCR和數(shù)字PCR的特點(diǎn)：

       5. 目前定量PCR已經(jīng)能實(shí)現(xiàn)高通量樣品條件下的自動(dòng)化操作。   

       6. 數(shù)字PCR在單分子層面上的***定量，可以徹底擺脫對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的依賴(lài)而直接給出靶序列的拷貝數(shù)，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果在批內(nèi)和批間的穩(wěn)定性，甚至能用來(lái)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)。   

       7. 基于***定量的方式，數(shù)字PCR結(jié)果的高重復(fù)性和高精度可實(shí)現(xiàn)微小差異的基因表達(dá)分析，如等位基因的不平衡表達(dá)、單細(xì)胞基因表達(dá)分析、microRNA表達(dá)分析等等。所謂“微小差異”的標(biāo)準(zhǔn)一般而言是指表達(dá)水平的差異在2倍以內(nèi)。   

       8. 同等條件下，數(shù)字PCR在靈敏度方面擁有優(yōu)勢(shì)，使得該技術(shù)已成為**的液態(tài)活檢、病原微生物檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因成分測(cè)定、宿主殘留DNA分析等的熱門(mén)技術(shù)。

浚和（上海）儀器有限公司是一家供應(yīng)國(guó)內(nèi)外先進(jìn)儀器和設(shè)備的專(zhuān)業(yè)供應(yīng)商和服務(wù)商，致力于為客戶提供專(zhuān)業(yè)的定制化解決方案。多年來(lái)，持續(xù)為醫(yī)藥、化工、高校、科研單位、檢測(cè)院等多個(gè)行業(yè)提供先進(jìn)的產(chǎn)品和專(zhuān)業(yè)的服務(wù)。

浚和在不斷引進(jìn)國(guó)內(nèi)外先進(jìn)儀器設(shè)備的同時(shí)，結(jié)合行業(yè)和市場(chǎng)需求，加強(qiáng)和客戶之間的溝通，并與國(guó)際上多家**儀器設(shè)備制造商保持著長(zhǎng)期穩(wěn)定的合作關(guān)系，不定期地與合作商進(jìn)行技術(shù)交流，努力加強(qiáng)自身技術(shù)力量。公司配備了數(shù)名有著多年行業(yè)經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員，依靠雄厚的技術(shù)實(shí)力、科學(xué)合理的配置方案、專(zhuān)業(yè)的安裝調(diào)試和周到的售后服務(wù)，得到了廣大用戶的支持與信賴(lài)。

公司主要經(jīng)營(yíng)產(chǎn)品包括：等離子清洗機(jī)、真空泵、噴霧干燥器、數(shù)字PCR、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、切片機(jī)、水分測(cè)定儀、激光粒度儀、光譜儀、溫濕度記錄儀等，目前主要合作品牌有：日本雅馬拓YAMATO、日本KASHIYAMA、日本HORIBA、廣州永諾 、日本KEM等。同時(shí)，公司還提供專(zhuān)業(yè)的技術(shù)服務(wù)，如設(shè)備的維護(hù)、驗(yàn)證等。

浚和儀器將始終以行業(yè)特點(diǎn)為立足點(diǎn)，以客戶需求為導(dǎo)向，不斷地提高自身專(zhuān)業(yè)技術(shù)能力，不停地完善客戶服務(wù)質(zhì)量，在發(fā)展中保持創(chuàng)新的精神，力求與客戶共同進(jìn)步，為行業(yè)的發(fā)展作出不懈的努力。