免疫組化SP三步法的具體實驗流程步驟簡介:1、石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水;2、0.3%或3%H2O2去離子水(無色液體)孵育10-30分鐘,以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性;3、蒸餾水沖洗,PBS浸泡5分鐘;4、候選步驟:采用抗原修復(fù):微波(建議30分鐘內(nèi)4次中火)、高壓、酶修復(fù)方法。自然冷卻,再用3分鐘×3次;5、血清封閉:室溫15-30分鐘,盡可能與二抗來源一致。傾去,勿洗;6、滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗,37℃孵育2~3小時或4℃過夜。PBS沖洗,3分鐘×5次;7、滴加生物素標(biāo)記的二抗,室溫或37℃孵育30分鐘-1h;8、BS沖洗,3分鐘×5次;9、滴加SP(鏈霉親和素-過氧化物酶),室溫或37℃孵育30分鐘-1h;0、PBS沖洗,3分鐘×5次;11、顯色劑顯色(DAB等);12、自來水充分沖洗;13、可進行復(fù)染,脫水,透明;14、選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?。免疫組化可幫助評估Tumor的惡性程度。韶關(guān)病理切片免疫組化原理
在免疫組化實驗中,優(yōu)化抗體孵育條件對于確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。以下是關(guān)于如何優(yōu)化抗體孵育條件的建議:1、溫度控制:抗體孵育的溫度通常可以在4°C、室溫或37°C之間進行選擇。4°C過夜孵育通常效果好,但時間較長。室溫或37°C孵育可以縮短時間,但可能增加非特異性結(jié)合的風(fēng)險。建議根據(jù)抗體說明書和實驗需求選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟取?、孵育時間:孵育時間的長短取決于抗體的濃度、親和力和目標(biāo)抗原的表達水平。一般來說,37°C下孵育1-2小時或4°C下過夜孵育是常見的選擇。若發(fā)現(xiàn)信號較弱,可適當(dāng)延長孵育時間;若背景染色較嚴(yán)重,則應(yīng)縮短孵育時間。3、抗體濃度:抗體濃度是影響孵育效果的關(guān)鍵因素之一。通常,建議從抗體說明書推薦的濃度開始,并根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果進行調(diào)整。若信號較弱,可適當(dāng)提高抗體濃度;若背景染色較嚴(yán)重,則應(yīng)降低抗體濃度。4、孵育環(huán)境:確保孵育環(huán)境濕潤,避免切片干燥。使用適當(dāng)?shù)姆跤谢驖窈?,確??贵w溶液均勻覆蓋組織切片。5、其他因素:注意避免抗體溶液的過度蒸發(fā),可加蓋濕紗布或使用其他保濕方法。在孵育過程中避免切片受到機械性損傷或污染。韶關(guān)病理切片免疫組化原理免疫組化技術(shù)不僅能用于基礎(chǔ)研究,也是臨床病理診斷不可或缺的方法之一。
免疫組化實驗設(shè)計中,對照組選擇對確保結(jié)果特異性和有效性至關(guān)重要。關(guān)鍵對照類型包括:1、空白對照:用PBS替代一抗,檢驗二抗非特異性結(jié)合及背景染色。2、陰性組織對照:選不表達目標(biāo)抗原組織,確認(rèn)抗體特異性,防假陽性。3、陽性組織對照:用已知陽性樣本驗證實驗敏感性及染色條件。4、同型對照:用非目標(biāo)抗原的相同物種抗體,檢測二抗非特異性。5、阻斷與預(yù)吸附對照:預(yù)飽和一抗以驗證染色特異性。6、序列特異性抗體對照:多克隆抗體實驗中,用單克隆抗體增強特異性驗證。7、實驗條件對照:調(diào)整修復(fù)條件等,優(yōu)化實驗參數(shù)。
在免疫組化實驗中,確保樣本的完整性和抗原的保存是實驗成功的關(guān)鍵。以下是一些關(guān)鍵步驟和注意事項:1、樣本準(zhǔn)備:獲取細(xì)胞或組織樣本后,應(yīng)盡快進行處理,避免長時間暴露于空氣中導(dǎo)致樣本干燥或污染。對于組織樣本,切割時應(yīng)盡量保持平整,避免過度擠壓或損傷組織。2、保存方法:細(xì)胞或組織樣本應(yīng)保存在適當(dāng)?shù)囊后w中,如福爾馬林或液氮,以保持樣本的完整性和保存時間。對于需要長期保存的樣本,可以考慮使用真空干燥法。3、切片技術(shù):使用冰凍切片或石蠟包埋切片時,應(yīng)確保切片過程平穩(wěn),避免過度牽拉或撕裂組織。切片厚度應(yīng)根據(jù)實驗需求進行調(diào)整,一般設(shè)置在3-5μm之間,以保證樣本的完整性和抗原的暴露。4、抗原保存:抗原應(yīng)保存在低溫條件下,如-20℃或-80℃的冰箱中,以減緩其降解速度。避免反復(fù)凍融,以免影響抗原的穩(wěn)定性和活性。5、實驗條件控制:在實驗過程中,應(yīng)嚴(yán)格控制溫度、濕度、pH值等條件,以確保樣本和抗原的穩(wěn)定性。使用高質(zhì)量的試劑和耗材,以減少實驗誤差和樣本損失。通過免疫組化可檢測特定蛋白的表達情況。
免疫組化操作需注意以下關(guān)鍵點:1. 固定:及時使用質(zhì)量好的固定液,保護抗原,避免自溶,確保結(jié)果準(zhǔn)確性。2. 脫水:徹底脫水防組織脫落,規(guī)范操作,專人負(fù)責(zé)記錄更換試劑。3. 切片:選擇粘附載玻片,推薦3-5μm厚度,無皺褶氣泡,適當(dāng)烤片以??乖粊G失。4. 抗原修復(fù):常用熱壓修復(fù)法暴露抗原。5. 內(nèi)源酶阻斷:用過氧化氫預(yù)處理,避免非特異性催化,提升檢測特異性。6. 抗體應(yīng)用:匹配一抗與二抗,濃度適宜,確保反應(yīng)特異有效。7. 顯色:DAB現(xiàn)配現(xiàn)用,控制顯色時間,避免過深背景,注意個人防護。8. 復(fù)染:蘇木素快速復(fù)染,增強對比度,便于觀察。9. 試劑保存:抗體需冷藏避光,避免反復(fù)凍融和交叉污染,留意有效期。10. 環(huán)境控制:維持18-22℃恒溫,尤其是在孵育階段,保證酶促反應(yīng)穩(wěn)定。遵循這些準(zhǔn)則,可有效提升免疫組化實驗的成功率和結(jié)果的可靠性。免疫組化的原理是什么?深圳組織芯片免疫組化掃描
免疫組化能分辨組織中各類細(xì)胞標(biāo)志物。韶關(guān)病理切片免疫組化原理
保存和運輸免疫組化樣本的關(guān)鍵點:1、快速固定(<20分鐘)于適量(樣本體積20倍)固定液中。2、使用適宜固定劑(如10%中性福爾馬林),掌握合適固定時間(6-24小時)。3、固定后室溫穩(wěn)定至少兩天,冰凍樣本-80℃保存,運輸時用干冰或冰袋維持低溫。4、完整標(biāo)注樣本信息,確保記錄無誤。5、選平底容器防損。6、定期更換固定液。7、運輸時密封防污染損壞。8、石蠟包埋前完成脫水、透明步驟。9、建議備份樣本。10、遵守相關(guān)法規(guī)和生物安全標(biāo)準(zhǔn)。合理措施確保樣本質(zhì)量與實驗準(zhǔn)確性。韶關(guān)病理切片免疫組化原理