外泌體的沉淀

Exosome（外泌體）是由活細胞分泌小囊泡，具有典型的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)；參與細胞之間的交流，物質(zhì)的運輸以及正常生理過程的維持，此外還與疾病的產(chǎn)生有關(guān)。對分離的外泌體進行體外標記或示蹤，有助于對外泌體的功能進行進一步的研究。目前對于外泌體的標記方法有很多種，包括親脂性的染料和膜滲透型的化合物等。PKH67的體內(nèi)熒光半衰期為10-12天。相比于PKH-67，PKH-26具有更長的半衰期，標記在兔紅細胞上的PKH26半衰期長達100天以上。特別適用于體外增殖研究以及長期的體內(nèi)細胞跟蹤研究。外泌體被包裹在堅硬的雙層膜中，雙層膜保護外泌體的內(nèi)容物，使外泌體能夠在組織中長距離移動。外泌體的沉淀

外泌體中包含的mRNAs和miRNAs在進入受體細胞后仍具有翻譯蛋白質(zhì)、促進病毒感ran等功能。據(jù)估計，單個外泌體含有約≤100拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)和≤10000拷貝數(shù)的核苷酸。不同細胞來源的外泌體中既包含與細胞形成、結(jié)構(gòu)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)的共有成分，也包含與來源細胞的生物功能相關(guān)的特異分子。如B淋巴細胞、樹突狀細胞、肥大細胞和腸上皮細胞來源的外泌體含有大量的主要組織相容性復合體蛋白質(zhì)MHCclassⅡ和MHCclassⅠ，血小板和T細胞來源的外泌體則包含諸如血管性血友病因子、穿孔素和顆粒酶等特殊蛋白質(zhì)，而ai細胞來源的外泌體表面可能含有中流特異的蛋白質(zhì)分子。這類特異分子在外泌體介導細胞信號轉(zhuǎn)導、參與生理病理過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。外泌體原液外泌體研究相對困難，需要盡快開發(fā)操作簡單、可提取高純度外泌體的技術(shù)。

通過對28例前列腺ai癥患者和19例正常人尿液外泌體中的miRNA進行深度測序分析，發(fā)現(xiàn)兩種miRNA(miR-196a-5p和miR-501-3p)在前列腺ai患者組明顯下調(diào)，表明尿液外泌體中的特異性miRNA可能作為前列腺ai的新型生物標志物。Khurana等［100］將研究對象由miRNAs擴大至多種類型RNA，通過對慢性腎病患者尿液外泌體中各類RNA進行系統(tǒng)研究，在慢性腎病患者組中識別出30種明顯差異的lncRNAs，表明尿液外泌體中的lncRNAs具有作為慢性腎病早期診斷標志物的潛力。Skotland等的研究則表明尿液外泌體中的脂質(zhì)能夠作為前列腺ai的新型標志物，3種脂質(zhì)標志物結(jié)合使用能夠有效提高對前列腺ai的診斷靈敏度(93%)和特異性(100%)。

膜封閉的囊泡釋放到周圍環(huán)境中已經(jīng)成為近幾年來越來越受關(guān)注的問題。令人信服的證據(jù)表明囊泡可交換復雜的信息有助于這種興趣的興起。但是，也已經(jīng)清楚，不同類型的分泌囊泡共存，具有不同的細胞內(nèi)起源和形成模式，因此可能具有不同的組成和功能。外泌體是分泌囊泡的一種亞型。它們在真核細胞內(nèi)的多泡小體中形成，并且當這些多泡小體與質(zhì)膜融合時分泌到細胞外。有趣的是，不同的分子家族已被證明參與細胞內(nèi)形成外泌體及其隨后的分泌，這表明即使在外泌體中也存在不同的亞型。因外泌體內(nèi)含mRNA、microRNA等核酸和蛋白質(zhì)對相鄰細胞具有交換信息的功能。

結(jié)果表明，PS親和法可以檢測到許多目前為止都無法檢測的外泌體蛋白質(zhì)和RNA。應(yīng)用Tim4的外泌體強結(jié)合能力，可用ELISA或FACS高靈敏度定性檢測、定量分析外泌體。以前無法用超速離心法提取的微囊泡，也通過運用PS親和法實現(xiàn)高純度提取。本指導書中對該技術(shù)進行詳細說明，這項技術(shù)的有用性今后將受到世界各方評價，有望在外泌體和微囊泡生理功能的分析研究上起重大貢獻。外泌體的檢測和提取還遇到一個困難即：對各種外泌體的分類。研究人員尚未統(tǒng)一定義以何種方法提取的細胞外囊泡可以稱之為外泌體，給實驗數(shù)據(jù)的分析和重復性確認帶來困難。近年，隨著國際細胞外囊泡協(xié)會的成立、世界性研究者研討會的舉辦，提案MISEV指南作為國際標準，計劃或已經(jīng)開始進行EV研究的科學家請務(wù)必閱讀這些方針。外泌體可參與到機體免疫應(yīng)答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化等方方面面。外周血外泌體提取試劑盒生產(chǎn)廠家

從外泌體中篩選的生物標志物，可用于疾病的診斷、預后及治理。外泌體的沉淀

外泌體的提取方法：免疫磁珠法，這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設(shè)備，但是非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性，不便進行下一步的實驗。PS親和法，該方法將PS（磷脂酰絲氨酸）與磁珠結(jié)合，利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。該方法與免疫磁珠法相似，獲得的外泌體形態(tài)完整，純度較高。由于不使用變性劑，不影響外泌體的生物活性，外泌體可用于細胞共培養(yǎng)和體內(nèi)注射。PS法可提取相當高純度的外泌體。色譜法，這種方法分離到的外泌體在電鏡下大小均一，但是需要特殊的設(shè)備，應(yīng)用不寬泛。外泌體的沉淀