宇枚博

雖然系統(tǒng)遞送的外泌體主要在肝臟、腎臟和脾臟中積累，但通過在外泌體的外表面上展示特定的靶向分子。例如，識(shí)別靶抗原的肽或抗體片段，可以獲得靶向外泌體；通過在細(xì)胞分泌囊泡上展示糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定的納米抗體，可以使細(xì)胞分泌囊泡顯示多種蛋白，包括抗體、熒光蛋白和信號(hào)分子。自然分泌的外泌體分離純化直接作為藥物的潛力有限，但是，將自然的外泌體分泌所需組分摻入合成脂質(zhì)體或納米顆粒中，并且使用可控程序組裝后的工程化外泌體模擬物在藥學(xué)上擁有更大的應(yīng)用潛力。幾乎沒有混入外泌體以外的蛋白，回收量高，操作重復(fù)性好。宇枚博

外泌體中存在著某些特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖,基于抗原–抗體特異性識(shí)別和結(jié)合作用原理,可將外泌體從其他組分中分離出來。四次跨膜蛋白家族、脂膜、膜聯(lián)蛋白、上皮細(xì)胞黏附分子或肝素等都可以作為抗原,而捕獲外泌體的抗體可以附著在平板、磁珠、二氧化硅、樹脂、膜親和過濾器、纖維素濾膜、聚酰氨基胺樹狀聚合物表面和微流控器件上。常用方法有酶聯(lián)免疫吸附法和磁珠法等。酶聯(lián)免疫吸附法使用聚苯乙烯微孔板作為抗體附著介質(zhì),其結(jié)果用吸光度值表示,該方法可以快速分析已知表面生物標(biāo)志物的表達(dá),也可以瞬時(shí)讀出外泌體的產(chǎn)量和特異性。磁珠法多使用共價(jià)包覆鏈霉親和素的磁珠,與樣品一起孵育后可通過磁泳將被結(jié)合的外泌體從樣品組分中分離出來。鑒于微米級(jí)磁珠可賦予更大的接觸面積,該方法不jin具有高度特異性,還具有比超速離心更高的外泌體產(chǎn)率。外泌體提取文獻(xiàn)在過去幾年中，有幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了各種細(xì)胞類型的外泌體分泌，并討論了其潛在的生物學(xué)功能。

尺寸排除色譜法是使用聚合物凝膠或類似的固定相柱進(jìn)行外泌體分離的技術(shù),樣品以重力滴落的方式收集。流體力學(xué)半徑較小的樣品組分進(jìn)入凝膠孔隙后,需耗費(fèi)相對(duì)較長的時(shí)間通過凝膠柱,導(dǎo)致延遲洗脫,實(shí)現(xiàn)不同粒徑大小顆粒分離。尺寸排除色譜法可以與差速離心法結(jié)合而不會(huì)明顯損失外泌體,保證產(chǎn)量的同時(shí)可有效去除雜質(zhì)蛋白,更適合目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)和miRNA的分析。靜水過濾透析法主要利用靜水壓力迫使樣品中不同特定大小分子先后通過透析管,其中溶劑和小溶質(zhì)很容易通過透析管,而較大的顆粒,如外泌體和其他囊泡,仍留在透析管中而被收集。

Knepper等通過對(duì)透射電鏡得到的200個(gè)囊泡進(jìn)行粒徑分析，結(jié)果表明尿液中外泌體的粒徑分布約為35～40nm，磷脂雙分子層厚度約為直徑的1/5～1/10。透射電鏡結(jié)合免疫金標(biāo)記法能夠得到外泌體表面特征分子的信息，有助于揭示外泌體的產(chǎn)生機(jī)制與來源。動(dòng)態(tài)光散射(dynamiclightscattering，DLS)和納米顆粒跟蹤分析(nanoparticletrackinganaly[1]sis，NTA)都是利用光學(xué)手段獲得囊泡粒徑分布的方法。兩者的不同之處在于動(dòng)態(tài)光散射通過檢測散射光的強(qiáng)度計(jì)算得到顆粒粒徑，而納米顆粒跟蹤分析通過追蹤單個(gè)粒子的運(yùn)動(dòng)軌跡計(jì)算得到樣品濃度、粒徑分布等信息。不同類別的外泌體囊泡有三個(gè)征：表面具涂層的膜泡、內(nèi)含纖維的膜泡、電子致密囊泡。

外泌體(Exosome)是由細(xì)胞分泌而來的微小囊泡，直徑約為30-200nm，形態(tài)也呈現(xiàn)出多樣性。microRNA(miRNA)是一種大小約21—23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70—90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。microRNA通過和靶基因mRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)。microRNA在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在動(dòng)物、植物等中發(fā)現(xiàn)的microRNA表達(dá)均有嚴(yán)格的組織特異性和時(shí)序性。microRNA在細(xì)胞生長和發(fā)育過程中起多種作用，包括調(diào)控發(fā)育、分化、凋亡和增殖等。細(xì)胞分泌到細(xì)胞外環(huán)境中分別稱為外泌體和微泡的細(xì)胞外膜泡。外泌體提取文獻(xiàn)

實(shí)際上，用PS親和法提取的人白血病細(xì)胞釋放的外泌體。宇枚博

通過對(duì)28例前列腺ai癥患者和19例正常人尿液外泌體中的miRNA進(jìn)行深度測序分析，發(fā)現(xiàn)兩種miRNA(miR-196a-5p和miR-501-3p)在前列腺ai患者組明顯下調(diào)，表明尿液外泌體中的特異性miRNA可能作為前列腺ai的新型生物標(biāo)志物。Khurana等［100］將研究對(duì)象由miRNAs擴(kuò)大至多種類型RNA，通過對(duì)慢性腎病患者尿液外泌體中各類RNA進(jìn)行系統(tǒng)研究，在慢性腎病患者組中識(shí)別出30種明顯差異的lncRNAs，表明尿液外泌體中的lncRNAs具有作為慢性腎病早期診斷標(biāo)志物的潛力。Skotland等的研究則表明尿液外泌體中的脂質(zhì)能夠作為前列腺ai的新型標(biāo)志物，3種脂質(zhì)標(biāo)志物結(jié)合使用能夠有效提高對(duì)前列腺ai的診斷靈敏度(93%)和特異性(100%)。宇枚博