外泌體裂解

來源: 發(fā)布時(shí)間:2023-04-09

細(xì)胞外囊泡是蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和脂質(zhì)運(yùn)輸來完成細(xì)胞間通訊通路的重要媒介,根據(jù)它們的大小和發(fā)生分為三類,包括外泌體、微泡和凋亡小體。其中,外泌體是直徑大約為40-100nm的包裝囊泡,由多種細(xì)胞分泌,內(nèi)含有特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞因子或遺傳物質(zhì)。來源于不同的組織的外泌體不只具有其特異性蛋白分子,而且還包含其行使功能的關(guān)鍵分子。近年來,隨著外泌體研究的不斷深入,它的應(yīng)用已經(jīng)涉及瘤子診療領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和免疫領(lǐng)域、寄生蟲領(lǐng)域;臨床研究上已涉及心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)等。在免疫系統(tǒng)中,據(jù)報(bào)道趨化因子受體CCR5通過外泌體在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移是細(xì)胞人類免疫缺陷病毒傳染的一種機(jī)制。外泌體裂解

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外泌體的相關(guān)成分:1、外泌體的膜同細(xì)胞一樣,是磷脂雙分子層。2、外泌體膜含有MHC-1/2蛋白,能綁定特異性的肽鏈。3、外泌體膜中有跨膜蛋白PGRL、LAMP1、LAMP2。4、外泌體膜中有膜轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白annexins、RAN、GTPases。5、外泌體膜上有脂質(zhì)筏Chol、ceramide、SM、PC,限制膜流動(dòng),參與包括跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)內(nèi)吞、脂質(zhì)及蛋白定向分選的多種功能。6、外泌體中含有核酸,包括miRNA、DNA、lncRNA、mRNA;同時(shí)還有一些蛋白、脂類也能被包裹到外泌體中。7、與外泌體產(chǎn)生相關(guān)的重要分子:Ral、ARF6、PLD2、RAB家族。8、一些物質(zhì)進(jìn)行外泌體中是特異性的:如hnRNPA2B1能結(jié)合lncRNA或miRNA特異性的序列(GGAG/CCCU),進(jìn)行主動(dòng)包埋。超速離心是目前分離外泌體的主要技術(shù)。北京外泌體miRNA芯片外泌體分離之后,需要經(jīng)過一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。

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細(xì)胞攝取診療性外泌體:從樹突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中分離出的診療性外泌體可對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生特定的作用,包括新抗原呈遞、免疫調(diào)節(jié)和藥物有效載荷傳遞。診療性外泌體對(duì)靶細(xì)胞的影響可能是通過不同的進(jìn)入或相互作用機(jī)制來控制的。完整的外泌體的進(jìn)入可能包括受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、網(wǎng)格蛋白包被小凹、脂筏、吞噬作用、小凹和大胞飲作用。外泌體內(nèi)容物的進(jìn)入或外泌體信號(hào)的誘導(dǎo)可能涉及配體受體誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)或融合,從而將外泌體內(nèi)容物沉積到細(xì)胞質(zhì)中。近年來,隨著外泌體研究的不斷深入,它的應(yīng)用已經(jīng)涉及醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和免疫領(lǐng)域、寄生蟲領(lǐng)域。

AFC自動(dòng)收集器是將qEV分離法這一過程自動(dòng)化的儀器,將用來收集外泌體樣本的微量離心管放置在AFC的中間轉(zhuǎn)盤內(nèi),根據(jù)稱重精確測(cè)量流體體積,可精確的測(cè)量到樣品中每一個(gè)液滴的重量并精確測(cè)量總重量。將在空隙體積之前從qEV柱洗脫的流體收集到AFC轉(zhuǎn)盤的單獨(dú)中心孔中并送至廢液桶,避免將不需要的空隙部分收集到微量離心管中。在提取期間,當(dāng)達(dá)到設(shè)定的提取體積后,轉(zhuǎn)盤會(huì)自動(dòng)旋轉(zhuǎn)到下一個(gè)微量離心管繼續(xù)收集,到收集完成后自動(dòng)停止。微滴式數(shù)字PCR技術(shù)不佳有效提高了核酸分子的擴(kuò)增效率,而且由于采用微滴計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行定量,可以不依賴與RT-PCR的熒光信號(hào)和Ct值,對(duì)所測(cè)樣品中的核酸分子進(jìn)行一定定量。外泌體存在于組織樣本中,如腦組織、肌肉組織、脂肪組織等。

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磁珠免疫法分離外泌體:將針對(duì)目的抗原的抗體通過生物素-鏈霉親和素連接到磁珠表面,然后將磁珠與樣品共孵育,使外泌體特異性結(jié)合到磁珠上形成磁珠-外泌體復(fù)合物,再用蒸餾水或者PBS沖洗,結(jié)尾用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脫獲得外泌體。該方法相對(duì)于ELISA的好處主要是,珠粒提供了更大的表面積來捕獲外泌體,從而提高了分離效率。此外,使用磁珠時(shí),樣品起始體積沒有上限,而基于微孔板的ELISA分析的較大樣品體積為100μL,且ELISA洗脫雜質(zhì)時(shí)容易造成孔間交叉污染。當(dāng)將磁珠法與金標(biāo)準(zhǔn)外泌體分離方法進(jìn)行比較時(shí),磁珠法可分離出更純凈的外泌體,特異性高、速度更快,并且不需要昂貴的儀器。另外,與其他分離方法相比,磁珠法不影響外泌體形態(tài)。但是采用磁珠法時(shí),外泌體生物活性易受PH和鹽濃度影響。外泌體具有異質(zhì)性,即使是同一種細(xì)胞分泌的外泌體都有可能具有比較大功能區(qū)別。外泌體試劑盒

外泌體顯示出了在診療各種疾病(如心肌病和神經(jīng)?。┓矫娴臐摿ΑM饷隗w裂解

外泌體的生物發(fā)生和鑒定。液體和細(xì)胞外成分,如蛋白質(zhì)、脂類、代謝物、小分子和離子,可以通過內(nèi)吞作用和質(zhì)膜內(nèi)陷,與細(xì)胞表面蛋白一起進(jìn)入細(xì)胞。由此產(chǎn)生的胞腔側(cè)質(zhì)膜芽的形成表現(xiàn)為質(zhì)膜的外-內(nèi)取向。這一出芽過程導(dǎo)致芽的形成可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、跨高爾基網(wǎng)絡(luò)(TGN)和線粒體預(yù)先形成的早期核內(nèi)體融合。ESEs也可以與ER和TGN融合,這可能解釋了內(nèi)吞物如何到達(dá)它們的。因此,一些ESEs可以包含膜和腔的成分,可以表示不同的起源。外泌體表面蛋白包括四聚體蛋白、整合蛋白、免疫調(diào)節(jié)蛋白等。外泌體可以包含不同類型的細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞內(nèi)蛋白、RNA、DNA、氨基酸和代謝物。外泌體裂解

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