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外泌體的提取分離的方法：1、超速離心法（差速離心）：超離法是較常用的外泌體純化手段，采用低速離心、高速離心交替進(jìn)行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡單，獲得的囊泡數(shù)量較多而廣受歡迎，但過程比較費時，且回收率不穩(wěn)定（可能與轉(zhuǎn)子類型有關(guān)），純度也受到質(zhì)疑；此外，重復(fù)離心操作還有可能對囊泡造成損害，從而降低其質(zhì)量。2、密度梯度離心：在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，是一種區(qū)帶分離法。通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集。此法獲得的外泌體純度較高，但步驟繁瑣，耗時。外泌體中含有核酸，包括miRNA、DNA、lncRNA、mRNA。羊水提取試劑盒廠家

外泌體分離的主要挑戰(zhàn)之一是消除納米級污染物，包括干擾外泌體標(biāo)志物解析的游離核酸和脂蛋白。超速離心是目前分離外泌體的主要技術(shù)。盡管如此，它仍難以符合臨床應(yīng)用所需的標(biāo)準(zhǔn)，主要是由于該方法得到的外泌體純度不足，產(chǎn)量較低，完整性欠佳且分離純化操作耗時長。其他方法，例如基于聚乙二醇（PEG）的沉淀，磷脂酰絲氨酸親和捕獲，尺寸排阻色譜法和膜親和捕獲，近年來已經(jīng)出現(xiàn)在特定的應(yīng)用中，但是只適用于特定場景。近來，非對稱流場-流分離方法已被用于從細(xì)胞和瘤子培養(yǎng)基中高分辨率地分選EV亞群，但其通量受到繁瑣的樣品制備程序的影響。單一分析耗時的過程也限制了其普遍的應(yīng)用。因此，目前亟需開發(fā)創(chuàng)新技術(shù)以提高外泌體分離純化的效率，純度，產(chǎn)量，速度和耐用性?；诔瑸V的技術(shù)提供了潛在的有前途的替代方法，但它們也有缺點。在切向流過濾中，使進(jìn)料流平行于多孔膜流動，以避免堵塞。然而，盡管已實現(xiàn)使用切向流過濾從大量條件細(xì)胞培養(yǎng)基中濃縮外泌體，但受制于其一次性模塊的成本高，高剪切應(yīng)力，難以處理小體積樣品等因素而難以應(yīng)用于臨床分析。體液外泌體提取試劑盒價格提取的外泌體的鑒定方式主要是通過形態(tài)學(xué)（電子顯微鏡技術(shù)）、粒子大小以及標(biāo)志蛋白等方式實現(xiàn)的。

外泌體提取在短時間（一周之內(nèi)）使用，可以放在4度保存，如果長時間保存可以放在-20度或-80度保存。也可以將外泌體進(jìn)行分裝，分別放在-20度或-80度。外泌體檢測方法：外泌體分離之后，需要經(jīng)過一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。鑒定方法從物理特征到表面分子標(biāo)志物，多角度進(jìn)行鑒定。l、透射電鏡鑒定法：簡稱TEM，適合外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀察，即通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形。2、納米顆粒追蹤分析法：簡稱NTA，該方法能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度快，檢測后能提供外泌體粒徑和濃度信息。

免疫印跡或蛋白質(zhì)印跡是分析外泌體較常用的方法之一，其原理是外泌體上特異性抗原與抗體結(jié)合。首先對樣品進(jìn)行處理將囊泡裂解并將蛋白質(zhì)變性，變性后，通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上并暴露于針對目的抗原的抗體中?？贵w特異性識別膜表面上的抗原，然后將膜暴露于第二抗體中。通過二抗的熒光標(biāo)簽或與二抗偶聯(lián)的辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶基團(tuán)進(jìn)行檢測。常用的標(biāo)記蛋白為CD63、CD81、TSG101和ALIX等。但是此方法的特異性和重復(fù)性會受到所用抗體質(zhì)量的限制。外泌體的直徑比微泡的要小，后者直徑為100nm-1μm。外泌體能夠穿過血腦屏障以將特定藥物輸送到中樞的神經(jīng)系統(tǒng)是外泌體遞送藥物的一個明顯優(yōu)勢。

外泌體中常見的細(xì)胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白，是鳥苷酸三磷酸酶家族的一種。它可以調(diào)節(jié)外泌體膜與受體細(xì)胞的融合，有文獻(xiàn)報道稱RAB4,RAB5和RAB11主要出現(xiàn)在早期以及回收的核內(nèi)體中，RAB7和RAB9主要出現(xiàn)在晚期的核內(nèi)體。現(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種RAB蛋白。除了RAB蛋白，外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白（包括膜聯(lián)蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。外泌體膜上富含參與外泌體運輸?shù)乃目缒さ鞍准易澹–D63,CD81和CD9)）、熱休克蛋白家族（(HSP60,HSP70,HSPA5,CCT2和HSP90以及一些細(xì)胞特異性的蛋白包括A33（結(jié)腸上皮細(xì)胞來源）、MHC-Ⅱ(抗原提呈細(xì)胞來源)、CD86(抗原提呈細(xì)胞來源)以及乳凝集素。外泌體的提取的方式：密度梯度離心法。方法外泌體提取

外泌體的存在：外泌體幾乎存在于所有的組織、細(xì)胞間隙、體液中。羊水提取試劑盒廠家

PEG沉淀法分離外泌體：通常通過將無水聚合物，如聚乙二醇（PEG），與樣品混合來沉淀外泌體。PEG聚合物競爭性結(jié)合水分子，增加疏水性蛋白和脂質(zhì)分子的相互結(jié)合力從而沉淀外泌體，然后通過離心分離外泌體。這種分離的方法快速，簡便，可用于各種起始體積（從100μL到幾毫升）適合于各種研究和臨床設(shè)定。然而，這種方法缺乏選擇性，PEG聚合物不只會導(dǎo)致外泌體小泡沉淀，還會引起其他細(xì)胞外囊泡、細(xì)胞外蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體沉淀。因此，在使用這種方法之前，必須進(jìn)行樣品預(yù)處理，例如過濾或超速離心，以減少較終的外泌體制劑的污染。羊水提取試劑盒廠家

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